Набор реагентов для клонирования продуктов ПЦР CloneJET™ представляет собой усовершенствованную систему положительной селекции чужеродных ДНК в ходе их высокоэффективного клонирования. Набор предназначен для клонирования ДНК-фрагментов, полученных в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с участием Pfu ДНК-полимеразы, Taq ДНК-полимеры, Taq ДНК-полимеразы Dream™ (ЕР0701) или других термостабильных ДНК-полимераз. С помощью этого набора можно также успешно клонировать и другие фрагменты ДНК, как с «тупыми», так и с «липкими» концами._x000D_ _x000D_ _x000D_ В состав набора входит специальный линейный вектор для клонирования pJET1.2/blunt, обеспечивающий положительную селекцию клонов. Он содержит область множественного клонирования, промотор T7 ДНК-полимеразы для транскрипции in vitro, а также «летальный» ген, структура которого нарушается при лигировании в вектор клонируемого фрагмента ДНК. Размер встраиваемой ДНК может составлять от 6 до 10000 пар нуклеотидов. Фосфорилирование фрагментов ПЦР не требуется. Лигирование в вектор pJET1.2/blunt фрагментов ДНК с «тупыми» концами, генерируемыми ДНК-полимеразами с корректирующей активностью, в вектор pJET1.2/blunt занимает 5 мин. _x000D_ _x000D_ Выступающие остатоки dA, образующиеся на 3ꞌ-концах продукта ПЦР при использовании Taq ДНК-полимеразы или других термостабильных ДНК-полимераз, лишенных корректирующей активности, перед лигированием в вектор удаляются специальным термостабильным ферментом, входящим в состав набора. Время этой реакции составляет 5 мин. Все распространенные лабораторные штаммы E. coli пригодны для трансформации рекомбинантной ДНК. _x000D_ Исходный циклизованный вектор pJET1.2/blunt после трансформации экспрессирует эндонуклеазу рестрикции, которая подвергает его гидролизу. Клетки E. coli, не содержащие рекомбинантный вектор, погибают при посеве. Вставка ПЦР продукта инактивирует «летальный» ген, что приводит к ингибированию синтеза эндонуклеазы рестрикции. В результате на культуральном планшете появляются только рекомбинантные клоны, содержащие вставку целевой ДНК. Таким образом, процедура клонирования существенно ускоряется из-за отсутствия необходимости проведения «сине-белого» теста. _x000D_ Праймеры, входящие в состав набора, позволяют провести секвенирование и подтвердить нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК._x000D_ _x000D_ _x000D_ Состав набора._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Компонент_x000D_ _x000D_ _x000D_ K1231 _x000D_ 20 экспериментов_x000D_ _x000D_ _x000D_ K1232 _x000D_ 40 экспериментов_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Вектор для клонирования pJET1.2/blunt (50 нг/мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Двукратный буфер для реакции_x000D_ _x000D_ _x000D_ 300 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 600 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Т4 ДНК-лигаза (5 ед.акт./мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Фермент для удаления «липких» концов ДНК_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Прямой праймер pJET1.2 для секвенирования (10 мкМ водный раствор)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 50 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 100 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Обратный праймер pJET1.2 для секвенирования (10 мкМ водный раствор)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 50 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 100 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Контрольный ПЦР-фрагмент длиной 976 пар нуклеотидов с дополнительными остатками dA на 3'-концах (24 нг/мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 8 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 12 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Вода без примеси нуклеаз_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,25 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,25 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Все компоненты набора протестированы в экспериментах по трансформации штаммов XL1-Blue. Эффективность трансформации–более 106 колонеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мкг ДНК. Эффективность клонирования контрольного продукта ПЦР превышает 2х104 КОЕ на 1 мкг ДНК. Более 90% рекомбинантных плазмид содержат целевую вставку._x000D_ _x000D_ _x000D_ Условия хранения: -20 °C.

T4 β-Глюкозилтрансфераза (T4 BGT) переносит глюкозный фрагмент уридиндифосфоглюкозы (UDP-глюкозы) в остатки 5-гидроксиметилцитозина (5-hmC) в двухцепочечной ДНК, продуцирующей β-глюкозил-5-гидроксиметилцитозин. _x000D_ _x000D_ Thermo Scientific T4 BGT специально разработан для быстрого времени реакции без ущерба для эффективности реакции. Фермент завершает 5-hmC-глюкозилирование 1 мкг ДНК при 37 ° C за 15 минут.

Экзонуклеаза фага лямбда - представляет собой высокопроцессную 5 '→ 3' экзодезоксирибонуклеазу. Он избирательно переваривает 5'-фосфорилированную нить двухцепочечной ДНК. Фермент проявляет низкую активность на одноцепочечной ДНК и нефосфорилированной ДНК и не обладает активностью в отношении ников и ограниченной активности при пробелах в ДНК.

Щелочная фосфатаза термочувствительная, FastAP™ катализирует выделение 5'- и 3'-фосфатных групп из ДНК, РНК и нуклеотидов. Этот фермент также удаляет фосфатные группы из белков. _x000D_ _x000D_ FastAP представляет собой новую щелочную фосфатазу, которая активна во всех буферах рестрикционных ферментов Thermo Scientific, а также в буферах ПЦР. Он дефосфорилирует все типы концов ДНК (тупые, 5'- и 3'-выступы) за 10 минут при 37 ° C. Фермент инактивируется через 5 минут при 75 ° C ( см. Рисунок 1 в вспомогательных данных). Поэтому удаление лигатуры щелочной фосфатазы не требуется. _x000D_ _x000D_ Основные моменты_x000D_ _x000D_ • Рекомбинантный фермент_x000D_ • Быстрое дефосфорилирование -10 минут при 37 ° C _x000D_ •Быстрая и полная инактивация - 5 минут при 75 ° C _x000D_ • Одновременное переваривание и дефосфорилирование векторной ДНК_x000D_ • 100% активность в рестрикционном ферменте и ПЦР-буферах _x000D_ • Очистка ПЦР в сочетании с Exo I_x000D_ • Дефосфорилирование белка _x000D_ _x000D_ Один протокол для всех типов концов ДНК :_x000D_ • 5'-выступы _x000D_ • 3'-выступы _x000D_ • тупые концы _x000D_ • одиночные нуклеотиды _x000D_ _x000D_ Применение_x000D_ _x000D_ • Дефосфорилирование клонирующей векторной ДНК для предотвращения рециркуляции во время лигирования _x000D_ • Одновременное переваривание и дефосфорилирование векторной ДНК _x000D_ • Очистка продукта ПЦР: деградация нуклеотидов до секвенирования продукта ПЦР_x000D_ • Дефосфорилирование нуклеиновой кислоты , 5'-концов до маркировки с Т4 полинуклеотидкиназы_x000D_ • Другие применения , где дефосфорилирование ДНК и РНК субстратов необходимо _x000D_ • Белок дефосфорилировани