Набор реагентов для клонирования продуктов ПЦР CloneJET™ представляет собой усовершенствованную систему положительной селекции чужеродных ДНК в ходе их высокоэффективного клонирования. Набор предназначен для клонирования ДНК-фрагментов, полученных в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с участием Pfu ДНК-полимеразы, Taq ДНК-полимеры, Taq ДНК-полимеразы Dream™ (ЕР0701) или других термостабильных ДНК-полимераз. С помощью этого набора можно также успешно клонировать и другие фрагменты ДНК, как с «тупыми», так и с «липкими» концами._x000D_ _x000D_ _x000D_ В состав набора входит специальный линейный вектор для клонирования pJET1.2/blunt, обеспечивающий положительную селекцию клонов. Он содержит область множественного клонирования, промотор T7 ДНК-полимеразы для транскрипции in vitro, а также «летальный» ген, структура которого нарушается при лигировании в вектор клонируемого фрагмента ДНК. Размер встраиваемой ДНК может составлять от 6 до 10000 пар нуклеотидов. Фосфорилирование фрагментов ПЦР не требуется. Лигирование в вектор pJET1.2/blunt фрагментов ДНК с «тупыми» концами, генерируемыми ДНК-полимеразами с корректирующей активностью, в вектор pJET1.2/blunt занимает 5 мин. _x000D_ _x000D_ Выступающие остатоки dA, образующиеся на 3ꞌ-концах продукта ПЦР при использовании Taq ДНК-полимеразы или других термостабильных ДНК-полимераз, лишенных корректирующей активности, перед лигированием в вектор удаляются специальным термостабильным ферментом, входящим в состав набора. Время этой реакции составляет 5 мин. Все распространенные лабораторные штаммы E. coli пригодны для трансформации рекомбинантной ДНК. _x000D_ Исходный циклизованный вектор pJET1.2/blunt после трансформации экспрессирует эндонуклеазу рестрикции, которая подвергает его гидролизу. Клетки E. coli, не содержащие рекомбинантный вектор, погибают при посеве. Вставка ПЦР продукта инактивирует «летальный» ген, что приводит к ингибированию синтеза эндонуклеазы рестрикции. В результате на культуральном планшете появляются только рекомбинантные клоны, содержащие вставку целевой ДНК. Таким образом, процедура клонирования существенно ускоряется из-за отсутствия необходимости проведения «сине-белого» теста. _x000D_ Праймеры, входящие в состав набора, позволяют провести секвенирование и подтвердить нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК._x000D_ _x000D_ _x000D_ Состав набора._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Компонент_x000D_ _x000D_ _x000D_ K1231 _x000D_ 20 экспериментов_x000D_ _x000D_ _x000D_ K1232 _x000D_ 40 экспериментов_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Вектор для клонирования pJET1.2/blunt (50 нг/мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Двукратный буфер для реакции_x000D_ _x000D_ _x000D_ 300 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 600 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Т4 ДНК-лигаза (5 ед.акт./мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Фермент для удаления «липких» концов ДНК_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Прямой праймер pJET1.2 для секвенирования (10 мкМ водный раствор)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 50 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 100 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Обратный праймер pJET1.2 для секвенирования (10 мкМ водный раствор)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 50 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 100 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Контрольный ПЦР-фрагмент длиной 976 пар нуклеотидов с дополнительными остатками dA на 3'-концах (24 нг/мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 8 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 12 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Вода без примеси нуклеаз_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,25 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,25 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Все компоненты набора протестированы в экспериментах по трансформации штаммов XL1-Blue. Эффективность трансформации–более 106 колонеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мкг ДНК. Эффективность клонирования контрольного продукта ПЦР превышает 2х104 КОЕ на 1 мкг ДНК. Более 90% рекомбинантных плазмид содержат целевую вставку._x000D_ _x000D_ _x000D_ Условия хранения: -20 °C.

ДНК бактериофага лямбда (da– dc– - это умеренный бактериофаг Escherichia coli. Вирионная ДНК является линейной и двухцепочечной (48502 п.о.) с одноцепочечными дополнительными 5'-концами длиной 12 п.о. После того как фаговая частица вводит свою хромосому в клетку, хромосома циркулирует по концевому соединению. В литическом пути экспрессируются гены фага, кодирующие репликацию, лизис и белки вирионов. Хромосома реплицируется, и реплики расщепляются и упаковываются в частицы фага потомства. В лизогенном пути экспрессия гена фага подавляется, и круговая хромосома встраивается в бактериальную хромосому путем рекомбинации.

Фрагмент Thermo Scientific Klenow является крупным фрагментом ДНК-полимеразы I. Он проявляет 5 '→ 3' полимеразную активность и 3 '→ 5' экзонуклеазную (корректирующую) активность, но не обладает 5 '→ 3' экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы I. _x000D_ _x000D_ Основные моменты_x000D_ _x000D_ • Включает в себя модифицированные нуклеотиды (например, Cy3-, Cy5-, аминоаллил-, биотин-, дигоксигенин- и флуоресцентно-меченные нуклеотиды). _x000D_ • Активен в рестрикционных ферментных, ПЦР, ОТ и T4 ДНК-лигазных буферах.

Изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG). Представляет собой высокостабильный синтетический аналог лактозы. Формула - C9H18O5S. Молекулярная масса–238,3. Чистота препарата, оцененная методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, составляет более 99%. IPTG инактивирует lac-репрессор и индуцирует синтез бета-галактозидазы, фермента, катализирующего реакцию расщепления лактозы на глюкозу и галактозу. Применяется для индукции экспрессии клонированных генов, находящихся под контролем lac-оперона. В сочетании с 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозидом (X-Gal) используется для проведения сине-белого теста при отборе клонов. Рекомендуется приготовление «сток»-раствора IPTG в воде (концентрация 100 мМ). Условия хранения +4 C.