Наборы клонирования pENTR ™ / D-TOPO® используют высокоэффективную стратегию клонирования 5 минут («клонирование TOPO®») для направленного клонирования продукта ПЦР тупого конца в вектор для входа в систему Gateway® или MultiSite Gateway ®. Продукт ПЦР с тупым концом направлен с направлением в сторону более 90% эффективности без применения лигазы, пост-ПЦР-процедур или рестрикционных ферментов. _x000D_ _x000D_ Комплект поставляется со всем необходимым для клонирования и выбора вашего усиленного гена PCR:_x000D_ _x000D_ • Gateway® System Ready - быстро перемещает клонированные гены между несколькими векторными системами. _x000D_ • Быстро и легко перейти от PCR к Gateway® Entry clone всего за 3 шага и как немного, как ~ 5 минут вовремя _x000D_ • Эффективно-Достичь более 90% клонов с правильной вставкой в ​​правильном направлении. _x000D_ • Проверенная надежность. Более десяти лет_x000D_ _x000D_ Комплекты для клонирования pENTR ™ / D-TOPO® Обзор_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ ВЕКТОР_x000D_ _x000D_ _x000D_ вектор pENTR ™ / D-TOPO®_x000D_ _x000D_ _x000D_ Направленный вектор клонирования для входа в систему шлюза_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ МЕТОД КОДИРОВАНИЯ_x000D_ _x000D_ _x000D_ Направленное клонирование TOPO®_x000D_ _x000D_ _x000D_ Топоизомераза I на основе 5-минутного направленного лигирования продуктов ПЦР с субстратной коррекцией с полимеразной амплификацией к вектору_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ КОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ_x000D_ _x000D_ _x000D_ Два варианта_x000D_ _x000D_ _x000D_ Выбирайте из комплектов с высокой эффективностью или быстро растущими компетентными ячейками_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Простой доступ к системе Gateway®_x000D_ Для доступа к системе Gateway® просто PCR усиливает ваш ген, представляющий интерес, и добавляет продукт прямо к предоставленному топоизомеразе, заряженному вектору pENTR ™ / D-TOPO®, инкубирует 5 минут и преобразует предоставленные компетентные E. coli . Полученные attL-содержащие квоты Gateway® Entry готовы для эффективной рекомбинации с вашим выбором векторов Gateway® Destination. _x000D_ _x000D_ Оптимизированный вектор pENTR ™ / D-TOPO® Vector_x000D_ Вектор pENTR ™ / D-TOPO® (фиг. 1) включает сайты секвенирования праймеров M13 и T7 и сайты рекомбинации attL, фланкирующие сайт для введения продукта PCR. Это позволяет легко проверять последовательности и рекомбинировать клоны в ваш выбор attR, содержащий векторы назначения Gateway®. Ген для резистентности к канамицину и источник pUC используются для селекции и высокоскоростного распространения в E.coli . _x000D_ _x000D_ Упрощенное наклонное клонирование_x000D_ С технологией клонирования Nirectional TOPO® нет необходимости в очистке ПЦР, подготовке вектора или других временных манипуляциях по обработке ДНК. Просто добавьте свою реакцию ПЦР прямо к предоставленному вектору, покрытому топоизомеразой, инкубируйте 5 минут, трансформируйте и получите до 90% направленных внутрь клонов. Четыре основных свеса на векторных парах с четырьмя базовыми последовательностями, сконструированными в прямом праймере, используемом в вашей реакции ПЦР, для обеспечения направленности реакции лигирования топоизомеразы (рисунок 2). _x000D_ _x000D_ Технология клонирования технологии Gateway® для рекомбинации_x000D_ Технология клонирования методом Gateway® обходит ограничения ограниченного ограничением клонирования, позволяя вам получить доступ к практически любой системе экспрессии в течение простого часа, 99% -эффективной и обратимой реакции рекомбинации Gateway®. Способность перемещать одну и ту же последовательность ДНК между различными векторами без использования рестрикционных ферментов, лигазы, этапов субклонирования, скрининга бесчисленных колоний или повторного секвенирования поможет сэкономить вам время, деньги и усилия. _x000D_ _x000D_ Ведущие технологии клонирования_x000D_ Когда дело доходит до клонирования, технология клонирования TOPO® и технология клонирования рекомбинации Gateway® были надежным партнером для тысяч ученых уже более десяти лет. Быстрое, простое в использовании и эффективное клонирование TOPO® и рекомбинация Gateway® позволяют быстро клонировать и последующей передачи генов между широким спектром векторов экспрессии Gateway®. _x000D_ _x000D_ Варианты комплектации_x000D_ Набор для клонирования pENTR ™ / D-TOPO® можно приобрести либо с помощью компетентных клеток TOP10 для стандартного клонирования, либо для компетентных клеток Mach1 ™ -T1R для быстрого роста. _x000D_ _x000D_ Только для исследования. Не предназначен для использования в терапевтических или диагностических целях для животных или человека.

Щелочная фосфатаза термочувствительная, FastAP™ катализирует выделение 5'- и 3'-фосфатных групп из ДНК, РНК и нуклеотидов. Этот фермент также удаляет фосфатные группы из белков. _x000D_ _x000D_ FastAP представляет собой новую щелочную фосфатазу, которая активна во всех буферах рестрикционных ферментов Thermo Scientific, а также в буферах ПЦР. Он дефосфорилирует все типы концов ДНК (тупые, 5'- и 3'-выступы) за 10 минут при 37 ° C. Фермент инактивируется через 5 минут при 75 ° C ( см. Рисунок 1 в вспомогательных данных). Поэтому удаление лигатуры щелочной фосфатазы не требуется. _x000D_ _x000D_ Основные моменты_x000D_ _x000D_ • Рекомбинантный фермент_x000D_ • Быстрое дефосфорилирование -10 минут при 37 ° C _x000D_ •Быстрая и полная инактивация - 5 минут при 75 ° C _x000D_ • Одновременное переваривание и дефосфорилирование векторной ДНК_x000D_ • 100% активность в рестрикционном ферменте и ПЦР-буферах _x000D_ • Очистка ПЦР в сочетании с Exo I_x000D_ • Дефосфорилирование белка _x000D_ _x000D_ Один протокол для всех типов концов ДНК :_x000D_ • 5'-выступы _x000D_ • 3'-выступы _x000D_ • тупые концы _x000D_ • одиночные нуклеотиды _x000D_ _x000D_ Применение_x000D_ _x000D_ • Дефосфорилирование клонирующей векторной ДНК для предотвращения рециркуляции во время лигирования _x000D_ • Одновременное переваривание и дефосфорилирование векторной ДНК _x000D_ • Очистка продукта ПЦР: деградация нуклеотидов до секвенирования продукта ПЦР_x000D_ • Дефосфорилирование нуклеиновой кислоты , 5'-концов до маркировки с Т4 полинуклеотидкиназы_x000D_ • Другие применения , где дефосфорилирование ДНК и РНК субстратов необходимо _x000D_ • Белок дефосфорилировани

Набор реагентов для клонирования продуктов ПЦР CloneJET™ представляет собой усовершенствованную систему положительной селекции чужеродных ДНК в ходе их высокоэффективного клонирования. Набор предназначен для клонирования ДНК-фрагментов, полученных в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с участием Pfu ДНК-полимеразы, Taq ДНК-полимеры, Taq ДНК-полимеразы Dream™ (ЕР0701) или других термостабильных ДНК-полимераз. С помощью этого набора можно также успешно клонировать и другие фрагменты ДНК, как с «тупыми», так и с «липкими» концами._x000D_ _x000D_ _x000D_ В состав набора входит специальный линейный вектор для клонирования pJET1.2/blunt, обеспечивающий положительную селекцию клонов. Он содержит область множественного клонирования, промотор T7 ДНК-полимеразы для транскрипции in vitro, а также «летальный» ген, структура которого нарушается при лигировании в вектор клонируемого фрагмента ДНК. Размер встраиваемой ДНК может составлять от 6 до 10000 пар нуклеотидов. Фосфорилирование фрагментов ПЦР не требуется. Лигирование в вектор pJET1.2/blunt фрагментов ДНК с «тупыми» концами, генерируемыми ДНК-полимеразами с корректирующей активностью, в вектор pJET1.2/blunt занимает 5 мин. _x000D_ _x000D_ Выступающие остатоки dA, образующиеся на 3ꞌ-концах продукта ПЦР при использовании Taq ДНК-полимеразы или других термостабильных ДНК-полимераз, лишенных корректирующей активности, перед лигированием в вектор удаляются специальным термостабильным ферментом, входящим в состав набора. Время этой реакции составляет 5 мин. Все распространенные лабораторные штаммы E. coli пригодны для трансформации рекомбинантной ДНК. _x000D_ Исходный циклизованный вектор pJET1.2/blunt после трансформации экспрессирует эндонуклеазу рестрикции, которая подвергает его гидролизу. Клетки E. coli, не содержащие рекомбинантный вектор, погибают при посеве. Вставка ПЦР продукта инактивирует «летальный» ген, что приводит к ингибированию синтеза эндонуклеазы рестрикции. В результате на культуральном планшете появляются только рекомбинантные клоны, содержащие вставку целевой ДНК. Таким образом, процедура клонирования существенно ускоряется из-за отсутствия необходимости проведения «сине-белого» теста. _x000D_ Праймеры, входящие в состав набора, позволяют провести секвенирование и подтвердить нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента ДНК._x000D_ _x000D_ _x000D_ Состав набора._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Компонент_x000D_ _x000D_ _x000D_ K1231 _x000D_ 20 экспериментов_x000D_ _x000D_ _x000D_ K1232 _x000D_ 40 экспериментов_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Вектор для клонирования pJET1.2/blunt (50 нг/мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Двукратный буфер для реакции_x000D_ _x000D_ _x000D_ 300 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 600 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Т4 ДНК-лигаза (5 ед.акт./мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Фермент для удаления «липких» концов ДНК_x000D_ _x000D_ _x000D_ 24 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 46 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Прямой праймер pJET1.2 для секвенирования (10 мкМ водный раствор)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 50 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 100 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Обратный праймер pJET1.2 для секвенирования (10 мкМ водный раствор)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 50 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 100 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Контрольный ПЦР-фрагмент длиной 976 пар нуклеотидов с дополнительными остатками dA на 3'-концах (24 нг/мкл)_x000D_ _x000D_ _x000D_ 8 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 12 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Вода без примеси нуклеаз_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,25 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,25 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Все компоненты набора протестированы в экспериментах по трансформации штаммов XL1-Blue. Эффективность трансформации–более 106 колонеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мкг ДНК. Эффективность клонирования контрольного продукта ПЦР превышает 2х104 КОЕ на 1 мкг ДНК. Более 90% рекомбинантных плазмид содержат целевую вставку._x000D_ _x000D_ _x000D_ Условия хранения: -20 °C.